聯名效應有多強?優衣庫×KAWS=瘋搶,Hi-C×CRISPR=高分文章
2019.06.13

優衣庫&KAWS聯名

近日優衣庫和KAWS聯名T恤遭“哄搶”,話題直接沖上微博熱搜第二位。這兩家強強聯手,群眾果斷配合,上演一場打架、扒衣、鉆門的動作大戲,這火熱程度,小編只是腦補了一下就渾身發抖......對此番運作,小編看得相當通透:兩家合作聯名,引發爆點!


在咱們基因測序領域的創新合作火熱程度不輸上述場面哦~舉個例子,CRISPR與Hi-C兩大技術在腫瘤研究中結成同盟,開啟了新的技術應用模式,接下來大家就跟隨小編一探究竟~

2018年,一篇關于前列腺癌(PCa)的文章《CRISPR-mediated deletion of prostate cancer risk-associated CTCF loop anchors identifies repressive chromatin loops》發表在Genome Biology上,以非編碼區風險基因作為切入點,開展前列腺癌遺傳易感性的研究,非常有效地發揮了Hi-C技術探究非編碼區遠程調控的優勢,同時基于CRISPR技術鑒定PCa細胞系中風險位點介導的CTCF loop是抑制性染色質環。接下來就順著文章思路一步一步開始解析。


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思路

前列腺癌非編碼區調控


PCa是美國男性癌癥死亡的第三大原因。值得注意的是,42%的PCa易感性可通過遺傳因素來解釋。因此,了解導致PCa潛在遺傳機制至關重要。

本研究選擇兩種前列腺細胞(PrEC和PWPE-1)及五種前列腺癌細胞(C4-2B、PWPE-2、22Rv1、LNCap、VCap),使用Hi-C聯合多組學篩選PCa風險相關的SNP位點,成功預測了一組PCa相關的非編碼區SNP,并就loop染色質環影響KCNN3及KRT78基因表達機制進行深入研究,整體思路非常清晰,見圖1。

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圖1 實驗設計流程圖



篩選

Hi-C聯合多組學確定PCa相關SNP

使用全基因組關聯研究(GWAS)篩選人類基因組中與疾病風險相關的SNP,約100萬到500萬個。接下來進行精細定位研究多種族和單個大型歐洲人群,鑒定出至少2,181個PCa風險相關SNP。

因絕大多數與風險相關SNP位于基因組的非編碼區域,縮小范圍,使用Hi-C測序,結合Chip- seq、RNA-seq技術,按照H3K27Ac或CTCF ChIP-seq峰、高置信度(HC)峰及位于DNase過敏位點(DHS)等條件篩選,確定活性調節區域中約300個候選SNP,結果展示見圖2、圖3。

 

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圖2 鑒定染色質環中涉及PCa風險相關調節元件的實驗和分析步驟


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圖3 與PCa風險相關H3K27Ac和loop的SNP

在選擇活性調節區域中的SNP子集后,為了鑒定PCa風險相關CTCF錨定區域是否實際控制特定基因的表達,使用CRISPR / Cas9系統刪除PCa風險相關的CTCF錨定區域,然后評估其影響,具體操作見圖4。


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圖4 與PCa風險相關CTCF結合位點基因編輯及驗證流程


驗證

CRISPR編輯不同CTCF結合位點

本研究選擇兩個PCa風險相關的CTCF錨定區域,一個在chr1上,一個在chr12上。這些區域都位于基因組的基因間區。

首先對PCa風險相關chr1 rs12144978位置的CTCF錨定區域(3個位點)開始驗證,發現CTCF結合位點3單獨缺失,KCNN3表達稍有增加(小于2倍),CTCF結合位點2和3同時缺失,KCNN3表達稍有增加(~7倍),而CTCF結合位點1單獨缺失,則導致KCNN3表達大幅增加(幾乎100倍),具體位點缺失與基因表達的關系見圖5、圖6。

 

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圖5 KCNN3在rs12144978附近的靶向CTCF位點缺失時上調


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 圖6 rs12144978相關loop結構分析

然后對PCa風險相關chr12 rs4919742位置上的CTCF錨定區域(3個位點)進行驗證,發現CTCF結合位點4單獨缺失,導致KRT78、KRT4KRT79和KRT80表達大量增加,尤其KRT78表達大幅增加(超過100倍),具體位點缺失與基因表達的關系見圖7圖8。

 

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圖7 KTR在rs4919742附近的靶向CTCF位點缺失時上調


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 圖8 rs4919742相關loop結構分析


模型

CTCF介導的環為抑制性環


通過上述研究發現,可能是PCa風險相關CTCF位點結合CTCF,阻止了KCNN3和KRT78基因的啟動子與位于環外的活性增強子相互作用。為了驗證這種作用模型,研究者在chr1 CTCF位點1或chr12 CTCF位點4的克隆群體中進行了H3K27Ac ChIP-seq。有趣的是,即使刪除了PCa風險相關的CTCF位點,這些區域仍然是增強子荒漠區。經分析發現其可能為另一種模型,即PCa風險相關CTCF介導的環路使KCNN3和KRT78啟動子與附近的活性增強子隔離,詳見圖9。

 

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圖9 PCa風險相關的CTCF環可以隔離位于環外的增強子基因

如果不是染色體構象捕獲技術的誕生,也許對于非編碼區的調控探索依舊是一籌莫展,如果不是基因編輯的有效驗證,也許一切都只能是猜想。如今越來越多的專家學者集中腫瘤研究領域,借助Hi-C和CRISPR兩大利器,深入探尋疾病發生的本質,為人類健康砥礪前行。話不多說,喜歡的話趕快收藏吧~

參考文獻:

Yu Guo, Andrew A, Perez, Dennis J, et al. CRISPR-mediated deletion of prostate cancer risk-associated CTCF loop anchors identifies repressive chromatin loops[J]. Genome Biology, 2018, 19:160.

文案:Hi-C 產品經理 谷文光




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